Genetika hemofilie

Hemofilie je dědičná porucha srážlivosti postihující převážně muže, jejíž výskyt je 1 z 10000 – 1 z 50000 u chlapců. Toto onemocnění je podmíněno vadou, neboli změnou v DNA (mutací), v jednom genu. V případě hemofilie A to je gen pro FVIII, u hemofilie B – FIX. Hemofilie má tzv. X-vázanou dědičnost, protože se oba geny nacházejí na pohlavním chromozómu X, což způsobuje rozdílný výskyt tohoto onemocnění u žen a mužů. Tyto vlastnosti dovolují genetickou diagnostiku hemofilie, což je zjišťování mutací u postižených osob a odhalování přenašeček v těchto rodinách, čímž se mimo jiné zabývá laboratoř pro poruchy hemostáze.

Zjišťování přenašeček bylo prováděno již v 19. století na základě sestavení rodokmenu. Například, pokud sestra muže postiženého hemofilií měla syna, který byl také postižen hemofilií, lze říct, že tato žena je přenašečka. Taktéž jsou přenašečky všechny dcery postiženého muže. V České republice je 55% případů, u kterých je výskyt hemofilie v rodině (familiární forma), zbývajících 45% jsou případy onemocnění bez předešlého výskytu v rodině (sporadická forma). V roce 1981 byla zavedena detekce přenašeček pomocí biochemické analýzy, ovšem tato metoda nebyla použitelná pro všechny případy. Od roku 1988 se začaly používat genetické metody založené na analýze DNA. Nejprve metoda PDRF (Polymorfizmy délky restrikčních fragmentů), pote sekvenování DNA. Genetickou analýzu lze rozdělit na dva typy: vazebná analýza (nepřímá diagnostika) a zjišťování mutace (přímá diagnostika). Jednoduše řečeno, vazebná analýza pátrá v rodině postižené osobě po genetickém znaku, který by se dědil společně s úsekem obsahujícím mutaci. Výhodou této diagnostiky je to, že není potřeba vědět, kde přesně se stala mutace. Je ovšem potřeba mít k dispozici DNA postižené osoby a co největší počet příbuzných. Ovšem se může stát, že provedená analýza nebude užitečná a neurčí, zda je zkoumaná osoba přenašečka. Vazebná diagnostika nemůže být použita, pokud matka není přenašečka. Jinými slovy, pokud se jedná o novou mutaci. V České republice 13% matek hemofiliků nejsou přenašečky. V takovém případě se provádí přímá diagnostika, což je zjišťování přesného úseku genu, kde došlo k mutaci. Tato diagnostika je velmi přesná, ovšem časově i finančně náročná, protože téměř každá rodina má svoji mutaci.

Doktorka Hrachovinová uvedla, že v České republice je v současné době 875 pacientů s hemofilií A (dle údajů z národního registru vrozených krvácivých stavů), z nichž u 441 je nalezena mutace, která vedla ke vzniku postižení. Celkově byla mutace zjišťována u 641 pacientů trpících hemofilií A. V případě pacientů s hemofilií B, mutace byla zjištěna u 73 pacientů ze 74 analyzovaných. Souhrnné údaje z let 1989-2011 ukazují, že bylo odhaleno 602 přenašečky hemofilie A celkem z 399 rodin a 96 přenašeček hemofilie B celkem ze 180 rodin.

Laboratoř poruchy hemostáze úzce spolupracuje s centry lékařské genetiky v Praze, Brně, Ostravě, Olomouci a jiných městech, kde poskytuje genetické a hematologické konzultace. Dle dat obsahujících údaje prenatální diagnostiky (tj. diagnostiky dítěte před jeho narozením) z let 1992 – 2011 z celkově provedených 188 analýz bylo zjištěno 42 plodů mužského pohlaví s hemofilií A a 3 plody mužského pohlaví s hemofilií B. Klinika Gennet, s.r.o. v současné době provedla preimplantační genetickou diagnostiku (diagnostika embrya před jeho implantací do dělohy budoucí matky) u čtyř rodin, která vedla k narození tří dětí. Tato diagnostika spočívá v tom, že po umělém oplození je u embrya ve 3. nebo 5. dní odebrána jedna buňka na genetickou analýzu. Na závěr doktorka Hrachovinová uvedla, že v současné době intenzivně spolupracuje s IVF centry pro zvýšení možností pro přenašečky plánující těhotenství.

Druhá přednáška měla název „Prenatální diagnostika a preimplantační genetická diagnostika“ a její autorkou byla M. D. Flora Peyvandi, Ph. D., pracovnice Centra hemofilie a trombózy, Univerzita v Milaně. Doktorka Peyvandi pověděla o prenatální diagnostice, jak invazivní, tak i neinvazivní. Přednáška byla také věnována preimplantační diagnostice a možnostem jejího využití v budoucnu pro diagnostiku hemofilie.

Prenatální diagnostika představuje soubor metod, které mohou být provedeny během těhotenství a poskytují informaci o vývoji plodu. Tyto metody lze rozdělit na invazivní a neinvazivní. K invazivním metodám patří odběr plodové vody (amniocentéza) a odběr choriových klků (choriocentéza). K neinvazivním metodám patří ultrazvukové vyšetření, analýza buněk plodu v mateřské krvi a analýza tzv. „volné“ neboli volně cirkulující DNA (deoxyribonukleová kyselina) plodu v mateřské krvi. V případě hemofilických pacientů se nejprve pátrá po mutaci, což může následně pomoct v prenatálním vyšetření u jejich sester nebo dcer, které jsou přenašečky. Žena, která je přenašečka, může podstoupit některou z invazivních metod, nebo neinvazivní metodu (určování pohlaví plodu z mateřské krve) anebo preimplantační diagnostiku. Cílem všech těchto metod je odlišit postižený plod od zdravého, v případě neinvazivní metody se rozhoduje pouze na základě pohlaví plodu.

Odběr choriových klků, což jsou prstovité výběžky placenty, může být proveden v 10. – 12. týdnu těhotenství a je spojen se zhruba 1% rizikem spontánního potratu. Odběr plodové vody se provádí později (15. – 16. týden) a má 0,5-1% riziko spontánního potratu.

Neinvazivní metoda analýzy „volné“ DNA byla průlomovým objevem v oblasti prenatální diagnostiky. Tato DNA pochází z buněk placenty, je detekovatelná v mateřské krvi od 4 týdnu těhotenství, polovina molekul je rozštěpena v mateřské krvi již po 16 minutách, a žádná volná DNA plodu není zjistitelná po 2 hodinách od porodu. „Volná“ plodová DNA poskytuje vzorek plodu pro prenatální diagnostiku bez rizika spontánního potratu a pocitů úzkosti, který zažívá matka během invazivní prenatální diagnostiky. V současné době se „volná“ DNA využívá pro určování pohlaví plodu, které se provádí pomocí analýzy úseků na chromozómu Y (tento chromozóm je přítomen pouze u mužů). Citlivost této metody (procento správně určených plodů mužského pohlaví) je v 4. – 7. týdnu těhotenství 73%, ovšem pokud odběr krve je prováděn v 8. a vyšším týdnu, potom je citlivost 94%. Bohužel v současné době má analýza „volné“ DNA značné omezení: není možné oddělit mateřskou DNA od DNA plodu. Určování pohlaví je možné na základě analýzy úseků, které matka nemá. Poškozený gen způsobující hemofilii dostává syn od matky, nelze tedy rozlišit, zda nalezený poškozený gen pochází od matky nebo od dítěte. Proto se vyvíjejí metody dovolující spolehlivě oddělit z mateřské krve buňky plodu. Jedná se například o vytvoření biočipu a nebo oddělení buněk plodu pomocí magnetických kuliček. Doktorka Peyvandi uvedla, že dle výsledků průzkumu Britské společnosti pro lidskou genetiku, neinvazivní určení pohlaví plodu snížilo počet invazivní prenatální diagnostiky o 45% u žen, které měly zvýšené riziko narození dítěte s nemocí, která má X-vázanou dědičnost.

Alternativou pro výše zmíněné metody prenatální diagnostiky je preimplantační genetická diagnostika. Tato diagnostika je indikována v případě výskytu dědičných onemocnění v rodině, četných potratů s podezřením na přítomnost chromozomálních abnormalit a u párů, které mají chromozomální abnormality zabraňující početí dítěte. V případě hemofilie existují dvě možné strategie. První strategie je výběr embryí pouze ženského pohlaví, což znamená ztrátu všech embryí mužského pohlaví, i když přibližně polovina z nich bude zdravá. Tato diagnostika byla poprvé provedena v roce 2004 ve Francii. Druhá strategie je zjištění mutace a výběr embryí, které nemají mutaci v nezávislosti na pohlaví. Poprvé bylo zjištění mutace v preimplantační diagnostice provedeno v případě hemofilie v roce 2006 ve Velké Britanii. I když preimplantační diagnostika vypadá velmi nadějně, má zatím omezení: vysoká cena, páry musí podstoupit procedury spojené s oplozením in vitro (ve zkumavce), určení diagnózy z 1 – 2 buněk a také s tím spojené riziko nesprávné diagnózy. Může se také stát, že všechna embrya budou postižena nebo budou mít mutaci.

Na závěr doktorka Peyvandi podotkla, že pokrok v molekulárních technologiích zvýšil možnosti neinvazivní prenatální diagnostiky a preimplantační diagnostiky, kterou lze v současné době považovat za dobře zavedenou metodu.

*Anastassiya Zidkova
anastazie.d@gmail.com*